NanoDrop微量分光光度計的應用

NanoDrop微量分光光度計的應用

快速評估您的樣品中所含的核酸、蛋白質和汙染物

當您知道樣品的含量和純度時，您便可以做出是否在下遊實驗中使用這些樣品的明智決(jue) 策。Thermo Scientific NanoDrop 分光光度計係列可以幫助您快速評估樣品中是否含有適量您所需的物質。根據您選擇的儀(yi) 器，軟件還可以在存在汙染物時提醒您並鑒別汙染物是什麽(me) 。

NanoDrop 分光光度計的核心功能是核酸和蛋白質定量分析與(yu) 純度評估，這是許多下遊應用（特別是 RT-qPCR 和質量控製）中的步驟。另外，該儀(yi) 器還支持細菌培養(yang) 生長、動力學等應用以及液體(ti) 聚合物 QC 等化學計量應用

核酸定量

傳(chuan) 統上，通過測定以下三個(ge) 分析波長處的紫外吸光度來定量核酸：230 nm、260 nm 和 280 nm。這些吸光度測量允許科學家測定核酸濃度並指示樣品純度。260 nm 處的最大吸光度峰的強度與(yu) 核酸濃度成正比。

該核酸定量方法的優(you) 勢在於(yu) 操作簡單、直接，僅(jin) 消耗少量樣品。然而，該方法存在的一個(ge) 問題是它缺乏特異性，因為(wei) 在這些波長處存在吸收的任何汙染物都會(hui) 導致獲得的核酸濃度不準確。

隨著紫外-可見光軟件的發展，研究人員現在可以在存在化學和核酸汙染物的情況下選擇性地定量核酸吸光度。Thermo Scientific Acclaro 智能技術軟件（賽默飛NanoDrop One/OneC 和 NanoDrop Eight 分光光度計中的標準軟件）使用全光譜數據和高級的算法來鑒別常見的核酸汙染物並提供經過校正的核酸濃度。Acclaro 算法可以檢測 RNA 中的 dsDNA 汙染以及 dsDNA 中的 RNA 汙染。您還可以輸入自定義(yi) 寡核苷酸序列，軟件將自動計算應用於(yu) 核酸定量的因子。

NanoDrop One/Oneᶜ 分光光度計上的預編程核酸應用

點擊以從(cong) 核酸主屏幕中選擇您需要的應用。

標記核酸的定量

熒光標記的核酸可通過微陣列預配置軟件方法進行定量，該方法可提供核酸濃度及標記濃度（支持兩(liang) 種染料）。該方法作為(wei) NanoDrop One/OneC 和 NanoDrop Eight 儀(yi) 器上的預配置應用提供。

汙染物鑒別

Acclaro 樣品智能技術使得 NanoDrop One/OneC 和 NanoDrop Eight 微量分光光度計能夠鑒別常見汙染物並提供真實的樣品濃度，從(cong) 而提供有關(guan) 樣品質量的更多信息。Acclaro 軟件納入了依賴於(yu) 光譜參考庫的算法。該軟件將這些算法應用於(yu) 樣品光譜，並使用化學計量數學原理對樣品汙染物進行預測。

Acclaro 汙染物鑒別

Acclaro 軟件已標記該 dsDNA 樣品（黃色圖標），因為(wei) 它被苯酚汙染。從(cong) 原始結果（總 A260，藍色）中減去苯酚的吸光度貢獻（橙色），得到了樣品中經過校正的真實 dsDNA 濃度（綠色）。

Acclaro 參考庫目前支持檢測 dsDNA 樣品中的蛋白質、苯酚、鹽酸胍和 RNA。另外還支持檢測 RNA 樣本中的蛋白質、苯酚、硫氰酸胍和 dsDNA。最後，它們(men) 允許檢測蛋白質樣品中的 DNA。未來將在參考庫中增加其他汙染物。

汙染物鑒別為(wei) 研究人員提供了兩(liang) 個(ge) 方麵的重要信息。首先，它可以鑒別可能存在於(yu) 樣品中的特定汙染物。此信息可能有助於(yu) 科學家解決(jue) 較難的提取或純化問題，並做出關(guan) 於(yu) 是否在下遊實驗中使用樣品的決(jue) 策。其次，它提供了經過校正的分析物濃度。當建立下遊反應（例如 PCR）時，DNA 濃度是一個(ge) 關(guan) 鍵參數，經過校正的濃度將有助於(yu) 科學家確保下遊實驗的成功。

例如，基因組 DNA 製備中出現 RNA 汙染是分子生物學工作流程中的一個(ge) 常見問題。使用傳(chuan) 統的分光光度法時，存在共純化的 RNA 會(hui) 人為(wei) 升高 DNA 濃度。通過使用全光譜數據和 Acclaro 軟件中提供的數學算法，研究人員可以鑒別 DNA 樣品中的 RNA 汙染，並查看經過校正的 DNA 濃度結果。

RT-qPCR 工作流程中的核酸定量

可靠的 RT-qPCR（定量逆轉錄 PCR）檢測需要仔細的實驗設計、全麵的質量控製 (QC) 以及透明的數據分析。

RT-qPCR QC 中核酸定量的重要性

核酸定量在 RT-qPCR 過程的兩(liang) 個(ge) 酶法步驟中都至關(guan) 重要。在逆轉錄步驟中，了解（和歸一化）進入反應的 RNA 量將有助於(yu) 大大減少 cDNA 生產(chan) 的變異性。在 PCR 步驟中，您必須確保有足夠的 cDNA 模板來確定樣品的基因型。

將 NanoDrop 分光光度計用於(yu) qPCR 工作流程

NanoDrop One 和 NanoDrop Eight 分光光度計非常適合定量和定性分析核酸樣品，作為(wei) 下遊 RT-qPCR 檢測的質量控製步驟。這些儀(yi) 器可提供準確的核酸濃度並鑒別可能改變實驗結果的汙染物，有助於(yu) 防止實驗失敗或不能發表結果。

NanoDrop One 和 Eight 儀(yi) 器內(nei) 置的 Acclaro 樣品智能技術可鑒別樣品中是否存在常見汙染物並計算出汙染物的近似濃度。核酸提取試劑盒中的常見分子可能會(hui) 導致分析物濃度值被高估或使 qPCR 聚合酶變性。無論發生哪種情況，qPCR 實驗都可能失敗。Acclaro 軟件可以提供經過校正的核酸濃度且可鑒定汙染物，從(cong) 而較大限度地減少對失敗實驗進行故障排除和管理所花費的時間。

蛋白質定量分析

科學家可以使用 NanoDrop 儀(yi) 器，通過直接或間接測量法定量分析樣品中的蛋白質含量。NanoDrop 紫外-可見光分光光度計支持在光譜的紫外波長範圍內(nei) 使用直接 A280 和 A205 測量應用以及在可見光譜範圍內(nei) 使用比色檢測對蛋白質樣品進行定量分析。

NanoDrop One/Oneᶜ 分光光度計上的預編程蛋白質應用

點擊以從(cong) 蛋白質主屏幕中選擇您需要的應用。

蛋白質 A280 是一個(ge) 直接測量應用程序，可直接根據樣品在280或205 nm 處的吸光度以及蛋白質特定消光係數來計算蛋白質濃度。直接測量是一種受研究人員歡迎的選擇，因為(wei) 其操作簡單，不需要試劑或標準品，並且隻消耗極少量樣品。與(yu) 核酸不同，蛋白質顯示出相當大的差異。蛋白質 A280 應用適用於(yu) 含有色氨酸 (Trp) 或酪氨酸 (Tyr) 殘基、半胱氨酸二硫鍵 (Cys-Cys) 並在280 nm 處顯示吸光度的純化蛋白質。

比色檢測（如 BCA、Bradford、Lowry 和 Pierce 660 nm ）是 間接測量應用，它們(men) 依賴生成標準曲線和產(chan) 生可顯示與(yu) 樣品中的蛋白質量成比例的顏色變化的反應。細胞提取物或裂解物等複雜混合物中的蛋白質建議使用蛋白質比色檢測進行測量。

蛋白質樣品評估是許多蛋白質工作流程中的一個(ge) 重要步驟。

為(wei) 蛋白質或肽樣品選擇適合的定量檢測

下列表格顯示了 NanoDrop 紫外-可見分光光度計上可用的蛋白質定量方法的濃度範圍、描述和注意事項以及不同儀(yi) 器上提供的各種方法。有關(guan) 這些檢測的更多信息，請參閱我們(men) 的蛋白檢測選擇指南

NanoDrop 分光光度計支持的蛋白質檢測方法

A280 可實現對大多數蛋白質和肽的快速簡單定量分析

純化蛋白質樣品可以使用 280 nm 處的直接吸光度進行準確測量，此處的吸光度主要歸因於(yu) Trp 和 Tyr 氨基酸上的芳香鏈。蛋白質 A280（我們(men) 軟件中的一種預配置應用）是較常用的定量方法，因為(wei) 它快速簡單、不需要試劑或標準曲線，且樣品消耗量極少。

與(yu) 核酸不同，每種純蛋白質都具有基於(yu) 氨基酸序列的比爾-朗伯消光係數。為(wei) 了獲得準確的結果，請從(cong) 菜單中選擇正確的樣品類型，或手動輸入其蛋白質消光係數。NanoDrop One 和 NanoDrop Eight 蛋白質編輯器功能使您能夠保存特定蛋白質的消光係數，以便您能夠自定義(yi) 您的樣品類型選項。

除測量濃度外，NanoDrop 分光光度計還可提供樣品中汙染物的相關(guan) 信息。Acclaro 樣品智能技術（包含在 NanoDrop One/OneC 和 NanoDrop Eight 儀(yi) 器上）使用數學算法來檢測蛋白質樣品中的核酸，並根據需要校正濃度結果。也可以通過測量 A260/A280 比值來評估樣品純度；比值 >1 可能表明蛋白質樣品中存在核酸汙染。

A205 是一種直接測量選擇方法，甚至適用於(yu) 不含酪氨酸和色氨酸的生物分子

如果蛋白質或肽不含 Trp 和 Tyr 殘基因此不能使用 A280 應用進行測量該怎麽(me) 辦？由於(yu) 蛋白質的肽骨架在 190-220 nm 處吸收光，因此不含 Tyr 或 Trp 殘基的肽可以通過測量 205 nm 處的吸光度來進行定量分析。蛋白質 A205 是 NanoDrop 軟件中的一個(ge) 預配置應用。

也可以通過選擇 Scopes 法選項，使用 A205 應用對含有大量 Trp 和 Tyr 的蛋白質進行定量。事實上，A205 方法相比 A280 蛋白質方法具有一些優(you) 勢，比如蛋白質間變異性較低（因為(wei) A205 消光係數並不基於(yu) 氨基酸組成）和靈敏度更高（因為(wei) 蛋白質在 205 nm 處具有較高的摩爾吸光係數）。盡管技術上的限製使得這些測量在過去很難進行，但 Nanodrop 儀(yi) 器的樣品保留技術和低雜散光性能簡化了通過 A205 方法定量少量蛋白質的流程。

A205 方法存在的一個(ge) 局限性是許多常用的蛋白質緩衝(chong) 液在 205 nm 處有吸光度。在使用這一技術之前，建議檢查蛋白質緩衝(chong) 液在 205 nm 處的吸光度貢獻。

細胞提取物或裂解物中蛋白質的比色檢測

細胞提取物或裂解物等複雜混合物中的蛋白質建議使用蛋白質比色檢測進行測量，如 Bradford、BCA、Lowry 或 Pierce 660nm 檢測。這些檢測可提供蛋白質特異性濃度，避免了在紫外範圍內(nei) 吸光並會(hui) 使 A280 增大的細胞組分的吸光度。這些應用和其他應用已預配置在選定的 NanoDrop 儀(yi) 器上。

使用 NanoDrop One/Oneᶜ 分光光度計進行 BCA 蛋白質檢測

BCA 檢測結果顯示總蛋白濃度（3 個(ge) 紅色菱形）和標準曲線。

標記蛋白質的定量

標記的抗體(ti) 或其他熒光標記的蛋白質和金屬蛋白可以使用提供蛋白質以及標記濃度（支持 2 種染料）的蛋白質和標記預配置軟件應用進行定量。該應用作為(wei) NanoDrop One/OneC 和 NanoDrop Eight 分光光度計上的預配置應用提供。

質量控製實驗室

現在，質量保證和質量控製比以往任何時候都更加重要。在繁忙的 QC 實驗室中，NanoDrop 分光光度計可使樣品濃度和純度分析變得可重現、常規和可靠。將下一代樣品質量評估集成到您的工作流程中產(chan) 生了很大影響，因為(wei) 時間非常寶貴，所有樣品的質量都至關(guan) 重要。

mRNA 疫苗質量控製

例如，在 mRNA 疫苗（在對抗 SARS-CoV-2 中至關(guan) 重要並且越來越多地用於(yu) 對抗其他病毒）的生產(chan) 過程中，樣品濃度和純度檢查在多個(ge) 步驟中都非常有用。

在測序階段，起始材料的質量和數量都是獲得準確結果的關(guan) 鍵。

在質粒生產(chan) 中，必須檢查純化血漿是否存在基因組 DNA 和其他汙染物。

在體(ti) 外轉錄中，必須先檢查純化 mRNA 的純度，然後再將 mRNA 溶液灌裝到疫苗小瓶中。

細菌培養(yang) 生長 (OD600)

可通過測量細菌培養(yang) 物在 600 nm 處的光密度 (OD600) 來監測細菌培養(yang) 物的生長。盡管這是微生物學中的核心技術，但這些光學密度測量通常隻能提供非常少的真實化學吸光度。相反，它們(men) 代表了由於(yu) 細菌懸液散射而未進入儀(yi) 器的檢測器的光量。

您可以使用 OD600 預編程應用在 NanoDrop OneC 和 NanoDrop Eight 分光光度計上測定 OD600。該軟件使用比爾-朗伯方程和用戶輸入的細胞數轉換係數自動將 OD600 值轉換為(wei) 每毫升細胞數。

請注意，在 NanoDrop OneC 儀(yi) 器上，使用底座和比色皿選件將提供不同的 OD600 值。您可以使用轉換係數來比較基座和比色皿測量值。

基於(yu) 時間的動力學測量

在 NanoDrop OneC 儀(yi) 器上，您可以對比色皿中的樣品進行基於(yu) 時間的動力學測量。您可以190-850 nm 範圍內(nei) 的三個(ge) 波長，按照用戶自定義(yi) 的時間間隔（最多 5 個(ge) 階段）進行連續的吸光度監測。比色皿測量提供擴大的檢測下限、可選的37°C加熱器和微型攪拌器。

您可以創建、編輯和保存動力學實驗作為(wei) 自定義(yi) 方法。

樣品動力學結果

使用 NanoDrop OneC，按照用戶定義(yi) 的時間間隔在 10 分鍾內(nei) 檢測了該比色皿樣品在 260、340 和 660 nm 處的吸光度。

NanoDrop 分光光度計的自定義(yi) 方法

如上文所述，NanoDrop 分光光度計預加載了核酸定量（如 dsDNA、ssDNA 和 RNA）和蛋白質定量（如 A280、BCA 和 Bradford）方法。您還可以在 NanoDrop One/OneC 或 NanoDrop Eight 分光光度計上創建自定義(yi) 方法來進行紫外-可見光測量或其他用戶定義(yi) 的測量以滿足您的需求，使儀(yi) 器能夠像傳(chuan) 統分光光度計一樣發揮作用。自定義(yi) 方法可以監測和報告 190-850 nm 範圍內(nei) 的多達 40 個(ge) 波長，並可以直接從(cong) 觸摸屏或 PC 控製軟件進行設置。自定義(yi) 方法支持將您的儀(yi) 器靈活用於(yu) 其他應用。

使用預先定義(yi) 的自定義(yi) 方法 來分析樣品，如通過 BCA 檢測分析納米顆粒、葉綠素、血紅蛋白、葡萄糖和蛋白質。

創建新的自定義(yi) 方法來分析您的特殊樣品，並保存方法供日後使用。

使用自定義(yi) 方法測量各種形式的血紅蛋白

例如，利用合適的消光係數和吸光度峰值，分光光度計可用來定量各種形式的血紅蛋白。

氧合血紅蛋白含有結合氧，在 414 nm、541 nm 和 576 nm 處顯示吸光度峰。

脫氧血紅蛋白不含結合氧，在 431 nm 處顯示吸光度峰。

高鐵血紅蛋白由於(yu) 含有高鐵離子而不能結合氧，在 406 nm 處顯示吸光度峰。

我們(men) 為(wei) NanoDrop One/OneC 儀(yi) 器創建了一種自定義(yi) 方法，用於(yu) 測量血紅蛋白在 406、414、431、541 和 576 nm（區分氧合血紅蛋白、脫氧血紅蛋白和高鐵血紅蛋白所需的五個(ge) 波長）處的吸光度。該結果圖顯示了高鐵血紅蛋白的典型吸收光譜。

高鐵血紅蛋白的典型吸收光譜

在 NanoDrop One 分光光度計上運行血紅蛋白自定義(yi) 測量方法，結果顯示在 406 nm 處有吸收峰，這是高鐵血紅蛋白的典型峰。另外，光譜未顯示氧合血紅蛋白中存在的 541 和 576 處的吸收峰。

化學計量方法

化學計量學是使用多變量數學模型和統計方法來同時確定很多組分的定量濃度信息。當用於(yu) 分析複雜化學樣品（混合物）的紫外-可見光數據時，化學計量學可以提供一種有效的方法來測定具有重疊光譜的化學物質的濃度。 過去，多變量校準模型的複雜性限製了其隻能由擁有相關(guan) 領域豐(feng) 富知識的人使用，因此大多數數據必須傳(chuan) 輸給經驗豐(feng) 富的化學計量學專(zhuan) 家進行收集後分析。

NanoDrop QC 軟件納入了化學計量學

Thermo Scientific NanoDrop QC 軟件為(wei) NanoDrop OneC 微量測量平台帶來了強大的化學計量分析功能。這種組合方式提供了一種具有吸引力的解決(jue) 方案，適用於(yu) 各種應用，包括石化分析、藥物純度、聚合物製造、食品染料應用以及需要化學計量分析的其他應用。

NanoDrop QC 軟件簡化了化學計量方法的開發和部署。開發方法的科學家可以收集所選化合物的光譜並將其導入 Thermo Scientific TQ Analyst 軟件，用於(yu) 構建方法。然後，可以將方法直接部署到的NanoDrop OneC 紫外-可見分光光度計上，使 QC 技術人員能夠在工作場地獲得合格/不合格和其他定量結果。

使用化學計量學方法對液體(ti) 聚合物進行 QC

基於(yu) 比色皿的紫外-可見光技術和基於(yu) PC 的化學計量軟件是對染料、潤滑劑和粘合劑等液體(ti) 進行質量分析的主要工具。這些溶液的樣品製備和分析可能包括多個(ge) 影響高價(jia) 值產(chan) 品放行的耗時步驟。我們(men) 的創新型自動調節基座紫外-可見分光光度計省去了稀釋高濃度樣品等耗時的步驟，並簡化了化學計量方法開發數據分析。

定量分析複雜混合物，即使其光譜重疊

在我們(men) 的化學計量學應用資料中，我們(men) 演示了逐步創建並驗證用於(yu) 確定複雜混合物中單種偶氮染料的濃度的化學計量學方法。我們(men) 展示了如何使用 NanoDrop QC 軟件來獲取包含多種具有高度重疊紫外-可見光光譜的組分的樣品的定量信息。

純檸檬黃和日落黃的全紫外-可見光譜 (200-700 nm)

使用 NanoDrop QC 軟件的紫外-可見光模塊采集光譜，並在 800 nm 處進行基線校正。製備每種染料的 10 mg/mL 和 2 µL 等分溶液，並在儀(yi) 器上測量。